Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись.

Невиданный прогресс фундаментальной науки во второй половине XX века обусловлен совершенствованием методик и экспериментального оборудования, вызванным бурным развитием технологий в послевоенные годы.  Микроскопия ещё со времен Левенгука являлась неотъемлемой частью научных исследований в области биологии, физики и материаловедения, — ведь не даром говорят, что «лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать». Однако возможности методов оптической микроскопии не безграничны, и в какой-то момент все уперлось в физические ограничения — разрешающая способность не превышала 0,2 мкм, что связано с так называемым дифракционным пределом.

Естественным выходом из ситуации было бы уменьшить длину волны, однако более коротковолновое излучение губительно для биологических объектов (например, рентгеновские лучи). Однако если не ставить целью наблюдение исключительно за живым объектом, то оказывается, что изучение «фиксированного» препарата способно дать чрезвычайно подробную информацию о внутреннем устройстве клетки.

Проблема увеличения разрешающей способности микроскопов без разрушения или изменения исследуемого образца была разрешена посредством технических решений, позволяющих визуализировать поверхность посредством интерпретации их физико-химических свойств, например способности отражать или поглощать электроны. Разработка таких методов как сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) и трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) позволила ученым преодолеть физические ограничения оптической микроскопии и перейти к изучению и визуализации объектов не только на клеточном, а и на молекулярном уровне, что чрезвычайно привлекало молекулярных биологов и биофизиков. Кроме того, в 80-х годах уже начали закладываться основы популярной в настоящее время дисциплины — нанотехнологий [1], для которой возможность изучать свойства и взаимодействия отдельных молекул или атомов — не прихоть, а самая насущная потребность. Мало того, ученые хотели не только «почувствовать» молекулы или атомы, получив различные спектры или измерив характеристики частиц, но и в прямом смысле слова увидеть эти структурные единицы жизни. Сама концепция нанотехнологий – переход к конструированию наноразмерных структур позволяет придать уже известным веществам новые свойства или усилить их действие и ставила перед исследователями новую задачу – найти и объяснить причины и механизмы такого явления. Решение такой задачи могло быть найдено лишь с применением новых высокотехнологичных методов исследования, позволяющих наблюдать и охарактреризовывать явления, происходящие на молекулярном и субмолекулярном уровнях. Таким образом, перед инженерами и учеными стояла задача разработки новых методов визуализации c нанометровой и субнанометровой разрешабщей способностью.

Концепция и предпосылки для разработки методов сканирующей зондовой микроскопии были представлены еще в 60-х годах двадцатого века, однако одним из важнейших этапов перехода к исследованиям на нано-  и даже субнаноуровнях была разработанная в 1981 году швейцарцем Гердом Биннигом (G. Binning) и немцем Генрихом Рорером (G. Rohrer) технология сканирующей туннельной микроскопии. Этих двух талантливых ученых физиков свела вместе работа в лаборатории IBM в Цюрихе, где представленная ими в 1982 году модель первого типа сканирующих зондовых микроскопов - сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) стала ключом, открывшим ученым дверь в мир исследований на атомарном уровне. Два талантливых исследователя смогли воплотить в жизнь, предложенную ранее Расселом Юингом (Russel Uing) концепцию использования туннельного эффекта для определения рельефа поверхности на микроуровне и за эту работу они были удостоены в 1986 году Нобелевской премии по физике (Рис.1).

 

Рис. 1. Герд Бинниг (G. Binning) и Генрих Рорер (G. Rohrer) вместе с первой моделью сканирующего туннельного микроскопа, за которую они и были удостоены Нобелевской премии в 1986 году.


Как же он работает?

            Если вы представите оптический микроскоп как человека с суперзрением, то сканирующий зондовый микроскоп можно описать как слепого человека с суперчувствительными пальцами. Как следует из названия метода, принцип сканирующей зондовой микроскопии заключается в сканировании поверхности образца сверхтонким зондом. Зонд  с толщиной кончика порядка нескольких нанометров позиционируется над образцом  и далее подводится к поверхности вплоть до появления взаимодейсвия кончика зонда с образцом, далее при сканировании значение взаимодействия поддерживается постоянным с помощью изменения расстояния между образцом и зондом. Таким образом, при сканировании  формируется изображение, отражающее свойства и топологию поверхности  (Рис 2). 


Рис. 2. Принципиальная схема устройства сканирующего зондового микроскопа: зонд подводится на крайне малое расстояние к образцу (порядка нескольких нанометров). Далее в зависимости от регистрируемого сигнала различают сканирующую туннельную микроскопию (сигнал туннельного тока между зондом и проводящей поверхностью) и атомно-силовую микроскопию (сигнал – силы молекулярных взаимодействий между зондом и поверхностью).

В зависимости от типа регистрируемого взаимодействия между зондом и поверхностью различают сканирующую туннельную (СТМ) и атомно-силовую микроскопию (АСМ). В случае первой (СТМ) подложка с образцом и зонд, сделанный из какого-либо проводящего металла (например, вольфрама или платины), замкнуты в общую электрическую цепь с источником тока (Рис. 3), и регистрируемой величиной является туннельный ток. Этот ток возникает при приближении зонда на достаточно малое расстояние к поверхности образца (туннельный эффект наблюдается на расстояниях порядка 1 нм).  В процессе сканирования туннельный ток поддерживается постоянным за счет изменения расстояния зонд-поверхность, и таким образом регистрируется изображение (Рис.3).


Рис. 3. Схема устройства сканирующего туннельного микроскопа. Когда зонд подходит к образцу на расстояние, достаточно малое для возникновения туннельного тока, начинается регистрация «полезного» сигнала. Этот сигнал представляет собой расстояние, пройденное опускающимся по оси Z зондом из исходной точки до позиции, где возникнает туннельный ток. Сигналы, полученные в каждой точке образца, складываются в цельное изображение поверхности.

Разработка сканирующей туннельной микроскопии значительно стимулировала прогресс в исследованиях разнообразных полупроводниковых и металлических материалов, поскольку данный метод позволяет не только изучать структуру на атоматном уровне, но и может быть использован для измерения электрического или магнитного полей, распределения электростатического потенциала поверхности в масштабе молекул или атомов. Так, например, использование СТМ позволило на практике изучать явление квантовых точек, существование которых теоретически было предположено еще в 1975 году. Еще одним важным примером использования сканирующей туннельной микроскопии стало исследование еще одного важного обьекта – углеродных нанотрубок (Рис 4).

Рисунок 4. Слева – модель структуры углеродной нанотрубки. Справа изображение сканирующей туннельной микроскопии углеродной нанотрубки. Разрешающая способность метода позволяет фиксировать положения атомов углерода в наноструктуре. Шкала соответствует 1 нм. [2].

Главным недостатком сканирующей туннельной микроскопии все еще является возможность исследования только проводящих образцов и невозможность работы в жидкостях, что зачастую исключает работу с биологическими объектами. Однако благодаря разработке метода атомно-силовой микроскопии ученые смогли перенести исследования биологических объектов на субнанометровый уровень.

В случае атомно-силовой микроскопии в качестве измеряемого параметра выбирается сила Ван-дер-Ваальсовых взаимодейсвий и силы электростатического отталкивания или притяжения, а зонд, называемый кантилевером, представляет собой тонкую иглу, закрепленную вертикально на тонкой эластичной балке (Рис 5). Проще говоря, метод основывается на регистрации притягивания или отталкивания атомов поверхности образца и атомов кончика зонда. На кончик балки направлен луч лазера, отражающийся от поверхности и далее поступающий на регистрирующее устройство. Регистрирующее устройство разбито на четыре сектора, а луч лазера попадает точно в середину детектора. В зависимости от изменения силы взаимодействия кантилевер-поверхность, происходит изгиб балки, несущей зонд, и луч лазера отклоняется от центральной позиции в один из секторов детектора. Система обратной связи изменяет положение кантилевера по оси z, возвращая лазер в “нулевое” центральное положение. Таким образом, регистрируя расстояния сдвига кантилевера, необходимые для возвращения лазера в “нулевую” точку, система регистрирует изменения топологии поверхности (Рис. 6).


Рисунок 5. Фотография сканирующей электронной микроскопии кантилевера, использующегося для контакта с образцом в атомно-силовой микроскопии. На кончике тонкой балки помещен зонд, кончик которого имеет лишь несколько нанометров диаметром. Именно этот кончик зонда и приходит во взаимодействие с поверхностью образца. Кантилеверы изготовляют из кремния, нитрида кремния или полимеров, сам процесс представляет химическое вытравливание головки зонда на кончике балки.


Рисунок 6. Принцип регистрации сигнала в методе атомно-силовой микроскопии. Лазерный луч отражается от кончика кантеливера и попадает в центр детектора, разцеленного на 4 сектора. При приближении зонда, находящегося на кончике балки, к поверхности образца вознкают силы притяжения или отталкивания, отклоняющие зонд. В качестве регистрируемого сигнала используется расстояние, на которое надо сдвинуть кантелевер, чтобы вернуть отклонившийся луч лазера в центральную точку.

Не только микроскоп.

Помимо базовых возможностей исследоваяния размеров и морфологии обьектов на нано- и субнаноуровнях (в случае сканирующей туннельной микроскопии), сканирующая зондовая микроскопия получила ряд модификаций. Наиболее ярким примером таких модификаций являются методы анодно-окислительной и силовой литографии, которые позволяют создавать или изменять не только форму или размеры наноструктур, но и влиять на электрохимические свойства образца посредством воздействия зонда на поверхность образца (Рис. 7).


Рис. 7. Изображение Mерлин Монро, полученное точечным окислением титана методом анодно-окислительной литографии, размер скана 7х11 мкм. (изображение получено сотрудниками компании НТ-МДТ, Россия)

На сегодняшний день методы атомно-силовой микроскопии нашли свое наиболее широкое применение в физике, электронике и метериаловедении. Возможность исследования размеров, структуры, магнитных и электрических свойств объектов сделало данные методы важной частью современных разработок в области микро- и наноэлектроники. Например, использование такого метода позволяет контролировать или модифицировать расположение элементов на миниатюрных чипах (Рис. 8). Одно из основных направлений развития современной электроники – миниатюризация. Уменьшение размеров микросхем и проводящих элементов напрямую связано со снижением энергозатрат и увеличением производительности современной техники. Уже в ближайшем будущем в отдельных наноразмерных контактах и проводящих элементах для переноса зарядов будут использоваться не более десятка электронов (в современных микросхемах эта цифра на несколько порядков выше). Именно для работы со столь малыми структурами идеально подходят методы сканирующей зондовой микроскопии.

В фундаментальных исследованиях также был найден широкий спектр применения этим методам: ученые смогли изучать структуру отдельных молекул, получая изображения, на которых видно расположение отдельных атомов в структуре молекулы (Рис. 9). Если проводить параллели с историей, то можно сказать, что СЗМ открыла ученым, до этого пользовавшимся «рисунками» молекул, мир фотографии на атомарном уровне, как это случилось в начале XIX века в макромире.


Рисунок 8. Изображение атомно-силовой микроскопии участка чипа. АСМ и СТМ позволяют проверять чипы на наличие дефектов, а в ряде случаев использоваться и для создания микро- или нано- структур из проводящих элементов. Это очередной шаг на пути миниатюризации электроники и повышении производительности вычислительных систем.


Рисунок 9. А – модель молекулы пентацена. В – изображение сканирующей туннельной микроскопии единичной молекулы пентацена. С и D – изображения атомно-силовой микроскопии единичной молекулы пентацена. Разрешающая способность метода позволяет различать расположения отдельных атомов в составе молекулы [3].

На службе биологии

Еще одним важным шагом вперед была разроботка модификаций сканирующих модулей, позволяющих производить сканирование в жидкости, что сделало доступным применение методов сканирующей зондовой микроскопии для исследования биологических объектов. Метод атомно-силовой микроскопии нашел применение в биохимии, молекулярной биологии во всем диапазоне размеров исследуемых обьектов от целых бактерий и клеток различных живых организмов до отдельных белковых молекул. Цели, решаемые методом АСМ в этом диапазоне размеров чрезвычайно разнообразны: идентификация микроорганизмов по их морфологии, исследование влияния различных веществ на жизнедеятельность клеток, визуализация и контроль образования фермент-субстратных комплексов, контроль размеров, структуры и стабильности различных наноструктур, использующихся для доставки лекарственных средств, визкализация единичных биомолекул и многое другое. Гибкость методик АСМ позволяет ученым находить все новые и новые применения методу в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии.

Для иллюстрации перечисленных выше возможностей АСМ для биологии спустимся вниз по лестнице размеров, рассматривая конкретные примеры. С помощью данного метода проводятся исследования антибактериального действия различных препаратов, например, на рисунке 10 представлены изображения бактерий E. coli до и после обработки низкомолекулярным и высокомолекулярным хитозаном – биополимером, который обладает антибактериальной активностью. На рисунке можно видеть, что с течением времени происходит изменение морфологии поверхности бактерий вплоть до полоного разрушения.


Рисунок 10. Исследование методом атомно-силовой микроскопии антибактериального действия биополимера хитозана на клетки E. coli. В левой колонке представлены изображения бактерий после обработки низкомолекулярным хитозаном, в правой колонке – после обработки высокомолекулярным хитозаном [4]. Данный полисахарид взаимодействует с клеточной стенкой бактерий, нарушая работу ионообменных каналов, что приводит к невозможности поддерживать электролитный баланс в клетке – следствием такого воздействия является  гибель бактерии. Хорошо видно, что в левом столбце происходит более быстрая гибель клеток, что указывает на  лучшую антибактериальную активность низкомолекулярного хитозана.

Атомно-силовая микроскопия используется для изучения действия различных лекарств или изменения внешних условий на клетки различного типа, в частности, на рисунке 11 приводится изображение симпатической нервной клетки человека. В ходе данного исследования ученые наблюдали изменения морфологии и механических свойств нервных клеток при воздействии различных нейротоксинов. АСМ сейчас применяется для исследований широкого спектра клеток человека, в том числе и раковых опухолей, нейронных сетей, стенок сосудов и многих других объектов человеческого организма.


Рисунок 11. Изображение симпатической нервной клетки человека, полученное методом атомно-силовой микроскопии [5].

Еще один важный аспект использования АСМ в современной биологии и и биотехнологии это определение размеров, стабильности и морфологиии различных наноструктур, использующихся для доставки лекарственных препаратов. Методы АСМ позволяют не только определять размеры наночастиц, но и контролировать степень загрузки лекарственным препаратом, склонность к аггрегации и некоторые другие параметры, способные помочь ученым при дальнейшей работе с исследуемым носителем. На рисунке 12 представлены наночастицы на основе хитозана и галактоманнана (А) до загрузки лекарственным препаратом лактоферрином, после загрузки (Б), а также наблюдать способность к агрегации таких наночастиц (В) и модель агрегата из 6 наночастиц, созданную на оснвое данных АСМ (Г) [6].


Рисунок 12. Использование атомно-сиорвой микроскопии для определения основных характеристик наночастиц на основе хитозана и галактоманнана.

Переходя к структрурным компонентам клетки АСМ позволяет, например, визуализировать конформационные и стуктурные изменения молекул ДНК, что дало возможность изучать влияния различных внешних факторов (например, УФ-излучения или радиации, рис. 13) на саму молекулу, определять места связывания различных ферментов и кофакторов, участвующих в транскрипции и репликации ДНК. Еще один интересный вариант использования метода при работе с ДНК – секвенирование с помощью СЗМ. Данный подход основан на возможности регистрировать зондом единичные основаня в структуре ДНК. Модификация кончика зонда позволит фиксировать поочередно положения каждого из четырех нуклеотидов в цепочке ДНК, далее из полученных положений каждого типа оснований и будет складываться последовательность генетического кода. Однако такой вариант секвенирования находится сейчас лишь в стадии разработки: ученым предстоит преодалеть еще целый ряд серьезных препятствий, в первую очередь это стремление к соотношению цена/скорость/точность, сравнимому с классическими методами секвенирования, прежде чем такой метод сможет найти коммерческое применение.


Рисунок 13. Изображения атомно-силовой микроскопии молекул ДНК до (А) и после (В) УФ-облучения. Хорошо видны конформационные изменения в структуре молекул после облучения (цепочки ДНК значительно сильнее скручены после облучения). Изображения компании НТ-МДТ.

Зачастую в околонаучной прессе можно увидеть статьи  о различных миниатюрных устройствах, микрофабриках или нанороботах, однако описывается это больше с точки зрения научной фантастики. На самом же деле ученые уже вплотную приблизились к разработке технологий, позволяющих воплотить в жизнь такие задумки. Прекрасной иллюстрацией может являться работа американских ученых, которые с помощью сканирующей туннельной микроскопии показали, что молекулы антрахинона, размещенные на очень ровной поверхности, двигаются по прямой линии и способны переносить с собой одну или две молекулы СО2 (Рис.13). При этом размер такого «молекулярного переносчика» состовляет не многим более 10 Å и является ярким примером детали биологических наномеханизмов, которые будут разрабатываться в ближайшем будущем.


Рис 13. На серии снимков сканирующей туннельной микроскопии представлены изображения молекулы антрахинона, несущего две (А) и одну (В) молекулы СО2 и изображения пошагового движения молекулы (С-F) [7]. Размер каждого изображения 20х40 А.

И это далеко не все

На сегодняшний день развитие самих методов СЗМ идет по направлению совершенствования технических ньюансов приборов, что позволит значительно увеличить разрешение и эффективность СЗМ. Например, разработка методов создания кантилеверов с толщиной зонда менее 1 нанометра  позволит увеличить разрешающую способность микроскопов вплоть до ее максимума в случае, когда кончик зонда будет иметь толщину в один атом.

Увеличение скорости сканирования (на сегодняшний день время получения одного изображения составляет от нескольких минут до нескольких десятков минут) позволит следить за движениями молекул в растворах вплоть до визуального изучения, например, ферментативных реакций.

Модификации кончиков зондов различными биомолекулами позволят исследовать физико-химические характеристики взаимодействий фермент-субстрат, антиген-антитело. Так, например, к иммобилизованному на поверхности субстрату на достаточное для взаимодействиея расстояние подводится кантилевер, модифицированный субстратсвязывающим доменом фермента. Далее измеряется сила, которую необходимо приложить для разрыва образовавшегося комплекса, величина этой силы с помощью математического аппарата может быть использована для определения характеристик взаимодействия в таком комплексе. Выше перечислены лишь немногие из возможных технических улучшений метода, позволяющих расширить его возможности.

При сегодняшних темпах развития науки и технологии уже в ближайшее десятилетие произойдет значительное усовершенствование сканирующих зондовых микроскопов, упрощение технологий их производства, что приведет к снижению цен на данную продукцию. Уже вскоре СЗМ будет являться таким же рутинным методом, каким сегодня является оптическая микроскопия, однако фронт работ будет переброшен уже на новый уровень – уровень исследований отдельных молекул и атомов...

Литература

1.     биомолекула: «Невидимая граница: где сталкиваются “нано” и “био”»;

2.     Ouyang M., Huang J.L., Cheung C.L., Lieber C.M. (2001). Atomically resolved single-walled carbon nanotube intramolecular junctions. Science 291, 97100;

3.     Gross L., Mohn F., Moll N., Liljeroth P., Meyer G. (2009). The chemical structure of a molecule resolved by atomic force microscopy. Science 325, 1110–1114;

4.     Eaton P., Fernandes J.C., Pereira E., Pintado M.E., Xavier Malcata F. (2008). Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy 108, 1128–1134;

5.     Mustata M., Ritchie K., McNally H.A. (2010). Neuronal elasticity as measured by atomic force microscopy. J. Neurosci. Methods 186, 35–41;

6.     А.В. Ильина, Н.М. Местечкина, Д.В. Курек, А.Н. Левов, П.И. Семенюк, В.Н. Орлов, В.Д. Щербухин, В.П. Варламов Получение, исследование и перспектива использования наночастиц на основе хитозана и галактоманнана. // Российские нанотехнологии, 2011, Т. 6, №1-2, С. 18-23.

7.     Wong K.L., Pawin G., Kwon K.Y., Lin X., Jiao T., Solanki U., Fawcett R.H., Bartels L., Stolbov S., Rahman T.S. (2007). A molecule carrier. Science 315, 1391–1393;

Комментарии

Войдите или зарегистрируйтесь, чтобы
принять участие в обсуждении